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A crescente demanda por comunicação por telefonia móvel levou ao surgimento contínuo de tecnologias sem fio (G), que podem ter diferentes impactos em sistemas biológicos. Para testar isso, expusemos ratos a uma exposição unilateral à radiação eletromagnética (EMF) de 1800 MHz da tecnologia LTE (4G Long-Term Evolution) por 2 horas. Em seguida, avaliamos o efeito da neuroinflamação aguda induzida por lipopolissacarídeo (LPS) na cobertura espacial da microglia e na atividade neuronal eletrofisiológica no córtex auditivo primário (ACx). A taxa de absorção específica (SAR) média no ACx foi de 0,5 W/kg. Registros multiunitários mostraram que a radiação LTE desencadeia uma redução na intensidade da resposta a tons puros e vocalizações naturais, enquanto aumenta o limiar acústico para frequências baixas e médias. A imuno-histoquímica para Iba1 não mostrou alterações na área coberta por corpos e processos microgliais. Em ratos saudáveis, a mesma exposição à radiação LTE não induziu alterações na intensidade da resposta e nos limiares acústicos. Nossos dados demonstram que a neuroinflamação aguda Sensibiliza os neurônios ao LTE-EMF, resultando em processamento alterado de estímulos acústicos no ACx.
O ambiente eletromagnético da humanidade mudou drasticamente nas últimas três décadas devido à expansão contínua das comunicações sem fio. Atualmente, mais de dois terços da população são considerados usuários de telefones celulares (TC). A disseminação em larga escala dessa tecnologia gerou preocupações e debates sobre os efeitos potencialmente perigosos dos campos eletromagnéticos (CEM) pulsados ​​na faixa de radiofrequência (RF), emitidos por TCs ou estações base e utilizados para codificar as comunicações. Essa questão de saúde pública inspirou diversos estudos experimentais dedicados a investigar os efeitos da absorção de radiofrequência em tecidos biológicos¹. Alguns desses estudos buscaram alterações na atividade da rede neuronal e nos processos cognitivos, dada a proximidade do cérebro às fontes de RF sob o uso generalizado de TC. Muitos estudos publicados abordam os efeitos de sinais modulados por pulsos usados ​​na segunda geração (2G) do sistema global para comunicações móveis (GSM) ou no acesso múltiplo por divisão de código de banda larga (WCDMA)/terceira geração do sistema universal de telecomunicações móveis (WCDMA/3G UMTS)²,³,⁴,⁵. Pouco se sabe sobre os efeitos dos sinais de radiofrequência usados ​​na quarta geração. Os serviços móveis 4G, que dependem de uma tecnologia de Protocolo de Internet totalmente digital chamada Long Term Evolution (LTE), foram lançados em 2011 e espera-se que alcancem 6,6 bilhões de assinantes LTE em todo o mundo em janeiro de 2022 (GSMA: //gsacom.com). Em comparação com os sistemas GSM (2G) e WCDMA (3G) baseados em esquemas de modulação de portadora única, o LTE usa Multiplexação por Divisão de Frequência Ortogonal (OFDM) como formato básico de sinal. Em todo o mundo, os serviços móveis LTE usam uma variedade de faixas de frequência diferentes entre 450 e 3700 MHz, incluindo as faixas de 900 e 1800 MHz também usadas no GSM.
A capacidade da exposição à radiofrequência (RF) de afetar processos biológicos é amplamente determinada pela taxa de absorção específica (SAR), expressa em W/kg, que mede a energia absorvida pelo tecido biológico. Os efeitos da exposição aguda da cabeça a sinais LTE de 2,573 GHz por 30 minutos na atividade da rede neuronal global foram recentemente explorados em voluntários humanos saudáveis. Utilizando ressonância magnética funcional (RMf) em repouso, observou-se que a exposição ao LTE pode induzir flutuações lentas espontâneas de frequência e alterações na conectividade intra ou inter-regional, enquanto os níveis de pico de SAR espacial, em média, em 10 g de tecido, foram estimados entre 0,42 e 1,52 W/kg, de acordo com os tópicos 7, 8 e 9. A análise de eletroencefalografia (EEG) sob condições de exposição semelhantes (duração de 30 minutos, nível de pico de SAR estimado em 1,34 W/kg usando um modelo representativo de cabeça humana) demonstrou redução da potência espectral e da coerência hemisférica nas bandas alfa e beta. No entanto, outros dois estudos baseados em análise de EEG constataram que 20 ou 30 minutos de exposição da cabeça ao LTE, com SAR local máximo, apresentaram efeitos semelhantes. Níveis definidos em torno de 2 W/kg não apresentaram efeito detectável¹¹ ou resultaram em diminuição da potência espectral na banda alfa, enquanto a cognição não se alterou na função avaliada pelo teste de Stroop¹². Diferenças significativas também foram encontradas nos resultados de estudos de EEG ou cognitivos que analisaram especificamente os efeitos da exposição a campos eletromagnéticos GSM ou UMTS. Acredita-se que essas diferenças decorram de variações no desenho metodológico e nos parâmetros experimentais, incluindo tipo e modulação do sinal, intensidade e duração da exposição, ou da heterogeneidade dos participantes humanos em relação à idade, anatomia ou sexo.
Até o momento, poucos estudos em animais foram utilizados para determinar como a exposição à sinalização LTE afeta a função cerebral. Recentemente, foi relatado que a exposição sistêmica de camundongos em desenvolvimento, desde o estágio embrionário tardio até o desmame (30 min/dia, 5 dias/semana, com uma SAR média de corpo inteiro de 0,5 ou 1 W/kg), resultou em alterações nos comportamentos motores e de apetite na idade adulta. A exposição sistêmica repetida (2 ha por dia durante 6 semanas) em ratos adultos induziu estresse oxidativo e reduziu a amplitude dos potenciais evocados visuais obtidos do nervo óptico, com uma SAR máxima estimada em apenas 10 mW/kg.
Além da análise em múltiplas escalas, incluindo os níveis celular e molecular, modelos de roedores podem ser usados ​​para estudar os efeitos da exposição à radiofrequência durante doenças, como anteriormente focado em campos eletromagnéticos GSM ou WCDMA/3G UMTS no contexto de neuroinflamação aguda. Estudos mostraram os efeitos em convulsões, doenças neurodegenerativas ou gliomas 16,17,18,19,20.
Roedores injetados com lipopolissacarídeo (LPS) são um modelo pré-clínico clássico de respostas neuroinflamatórias agudas associadas a doenças infecciosas benignas causadas por vírus ou bactérias que afetam a maioria da população a cada ano. Esse estado inflamatório leva a uma doença reversível e a uma síndrome comportamental depressiva caracterizada por febre, perda de apetite e redução da interação social. Fagócitos residentes do SNC, como a microglia, são células efetoras-chave dessa resposta neuroinflamatória. O tratamento de roedores com LPS desencadeia a ativação da microglia, caracterizada pela remodelação de sua forma e processos celulares e por profundas alterações no perfil do transcriptoma, incluindo a regulação positiva de genes que codificam citocinas ou enzimas pró-inflamatórias, que afetam as redes neuronais.^{22, 23, 24}
Ao estudar os efeitos de uma única exposição da cabeça a campos eletromagnéticos GSM de 1800 MHz durante 2 horas em ratos tratados com LPS, descobrimos que a sinalização GSM desencadeia respostas celulares no córtex cerebral, afetando a expressão gênica, a fosforilação do receptor de glutamato, a atividade neuronal evocada por estímulos meta-sensoriais e a morfologia da microglia no córtex cerebral. Esses efeitos não foram detectados em ratos saudáveis ​​que receberam a mesma exposição a campos eletromagnéticos GSM, sugerindo que o estado neuroinflamatório desencadeado pelo LPS sensibiliza as células do SNC à sinalização GSM. Concentrando-nos no córtex auditivo (ACx) de ratos tratados com LPS, onde a taxa de absorção específica (SAR) local média foi de 1,55 W/kg, observamos que a exposição a campos eletromagnéticos GSM resultou em um aumento no comprimento ou ramificação dos processos microgliais e uma diminuição nas respostas neuronais evocadas por tons puros e estímulos naturais.
No presente estudo, nosso objetivo foi examinar se a exposição exclusiva da cabeça a sinais LTE de 1800 MHz também poderia alterar a morfologia da microglia e a atividade neuronal no córtex cingulado anterior (ACx), reduzindo a potência da exposição em dois terços. Demonstramos aqui que a sinalização LTE não teve efeito sobre os processos microgliais, mas ainda assim desencadeou uma redução significativa na atividade cortical evocada por som no ACx de ratos tratados com LPS, com um valor de SAR de 0,5 W/kg.
Considerando evidências anteriores de que a exposição à frequência GSM-1800 MHz alterava a morfologia da microglia em condições pró-inflamatórias, investigamos esse efeito após a exposição à sinalização LTE.
Ratos adultos foram injetados com LPS 24 horas antes da exposição simulada (apenas na cabeça) ou da exposição a LTE-1800 MHz. Após a exposição, respostas neuroinflamatórias desencadeadas por LPS foram estabelecidas no córtex cerebral, conforme demonstrado pela regulação positiva de genes pró-inflamatórios e alterações na morfologia da microglia cortical (Figura 1). A potência aplicada pela cabeça ao LTE foi ajustada para obter um nível médio de SAR de 0,5 W/kg no córtex auditivo (Figura 2). Para determinar se a microglia ativada por LPS respondia ao campo eletromagnético (CEM) do LTE, analisamos seções corticais coradas com anti-Iba1, que marca seletivamente essas células. Como mostrado na Figura 3a, em seções do córtex auditivo fixadas de 3 a 4 horas após a exposição simulada ou ao LTE, a microglia apresentava uma aparência notavelmente semelhante, exibindo uma morfologia celular "densa" induzida pelo tratamento pró-inflamatório com LPS (Figura 1). Consistente com a ausência de respostas morfológicas, a análise quantitativa de imagem não revelou diferenças significativas na área total (teste t não pareado, p < 0,05). p = 0,308) ou área (p = 0,196) e densidade (p = 0,061) da imunorreatividade de Iba1 ao comparar a exposição a corpos celulares corados com Iba 1 em ratos LTE versus animais expostos a placebo (Fig. 3b-d).
Efeitos da injeção intraperitoneal de LPS na morfologia da microglia cortical. Visão representativa da microglia em um corte coronal do córtex cerebral (região dorsomedial) 24 horas após injeção intraperitoneal de LPS ou veículo (controle). As células foram coradas com anticorpo anti-Iba1 conforme descrito anteriormente. O tratamento pró-inflamatório com LPS resultou em alterações na morfologia da microglia, incluindo espessamento proximal e aumento de ramificações secundárias curtas dos processos celulares, resultando em uma aparência "densa". Barra de escala: 20 µm.
Análise dosimétrica da taxa de absorção específica (SAR) no cérebro de ratos durante a exposição a LTE de 1800 MHz. Um modelo heterogêneo previamente descrito de rato fantasma e antena de laço⁶² foi utilizado para avaliar a SAR local no cérebro, com uma grade cúbica de 0,5 mm³. (a) Visão geral de um modelo de rato em um cenário de exposição com uma antena de laço acima da cabeça e uma almofada térmica metálica (amarela) abaixo do corpo. (b) Distribuição dos valores de SAR no cérebro adulto com resolução espacial de 0,5 mm³. A área delimitada pelo contorno preto na seção sagital corresponde ao córtex auditivo primário, onde a atividade microglial e neuronal é analisada. A escala de cores dos valores de SAR se aplica a todas as simulações numéricas mostradas na figura.
Micróglia injetada com LPS no córtex auditivo de ratos após exposição a LTE ou exposição simulada. (a) Vista empilhada representativa de micróglia corada com anticorpo anti-Iba1 em cortes coronais do córtex auditivo de ratos perfundidos com LPS, 3 a 4 horas após exposição simulada ou a LTE (exposição). Barra de escala: 20 µm. (b, c) Avaliação morfométrica da micróglia 3 a 4 horas após exposição simulada (pontos abertos) ou a LTE (expostos, pontos pretos). (b, c) Cobertura espacial (b) do marcador de micróglia Iba1 e áreas de corpos celulares Iba1-positivos (c). Os dados representam a área de coloração anti-Iba1 normalizada pela média dos animais expostos à condição simulada. (d) Contagem de corpos celulares de micróglia corados com anti-Iba1. As diferenças entre os animais submetidos à condição simulada (n = 5) e a LTE (n = 6) não foram significativas (p > 0,05, teste t não pareado). Na parte superior e inferior da caixa, as linhas superior e inferior representam, respectivamente, os percentis 25-75 e 5-95. O valor médio está marcado em vermelho na caixa.
A Tabela 1 resume o número de animais e os registros de múltiplas unidades obtidos no córtex auditivo primário de quatro grupos de ratos (Sham, Exposto, Sham-LPS e Exposto-LPS). Nos resultados apresentados a seguir, incluímos todos os registros que exibem um campo receptivo temporal espectral (CRTE) significativo, ou seja, respostas evocadas por tons com pelo menos 6 desvios padrão acima das taxas de disparo espontâneo (ver Tabela 1). Aplicando esse critério, selecionamos 266 registros para o grupo Sham, 273 registros para o grupo Exposto, 299 registros para o grupo Sham-LPS e 295 registros para o grupo Exposto-LPS.
Nos parágrafos seguintes, descreveremos inicialmente os parâmetros extraídos do campo receptivo espectro-temporal (isto é, a resposta a tons puros) e a resposta a vocalizações específicas xenogênicas. Em seguida, descreveremos a quantificação da área de resposta em frequência obtida para cada grupo. Considerando a presença de "dados aninhados"30 em nosso delineamento experimental, todas as análises estatísticas foram realizadas com base no número de posições na matriz de eletrodos (última linha da Tabela 1), mas todos os efeitos descritos a seguir também foram baseados no número de posições em cada grupo. Número total de registros multiunitários coletados (terceira linha da Tabela 1).
A Figura 4a mostra a distribuição de frequência ideal (BF, que provoca resposta máxima a 75 dB SPL) dos neurônios corticais obtidos em animais submetidos à cirurgia simulada (Sham) e em animais expostos ao LPS. A faixa de frequência da BF em ambos os grupos foi estendida de 1 kHz a 36 kHz. A análise estatística mostrou que essas distribuições foram semelhantes (qui-quadrado, p = 0,278), sugerindo que as comparações entre os dois grupos podem ser feitas sem viés de amostragem.
Efeitos da exposição à LTE em parâmetros quantificados de respostas corticais em animais tratados com LPS. (a) Distribuição do fluxo sanguíneo (FS) em neurônios corticais de animais tratados com LPS e expostos à LTE (preto) e animais submetidos a exposição simulada à LTE (branco). Não há diferença entre as duas distribuições. (bf) Efeito da exposição à LTE em parâmetros que quantificam o campo receptivo temporal espectral (CRTE). A intensidade da resposta foi significativamente reduzida (*p < 0,05, teste t não pareado) tanto no CRTE (intensidade total da resposta) quanto nas frequências ótimas (b, c). Duração da resposta, largura de banda da resposta e constante de largura de banda (df). Tanto a intensidade quanto a confiabilidade temporal das respostas às vocalizações foram reduzidas (g, h). A atividade espontânea não foi significativamente reduzida (i). (*p < 0,05, teste t não pareado). (j, k) Efeitos da exposição à LTE nos limiares corticais. Os limiares médios foram significativamente maiores em ratos expostos à LTE em comparação com ratos submetidos a exposição simulada. Esse efeito é mais pronunciado em As frequências baixas e médias.
As Figuras 4b-f mostram a distribuição dos parâmetros derivados do STRF para esses animais (médias indicadas por linhas vermelhas). Os efeitos da exposição ao LTE em animais tratados com LPS pareceram indicar uma diminuição da excitabilidade neuronal. Primeiramente, a intensidade geral da resposta e as respostas foram significativamente menores em animais BF em comparação com animais Sham-LPS (Fig. 4b,c; teste t não pareado, p = 0,0017; e p = 0,0445). Da mesma forma, as respostas aos sons de comunicação diminuíram tanto na intensidade da resposta quanto na confiabilidade entre tentativas (Fig. 4g,h; teste t não pareado, p = 0,043). A atividade espontânea foi reduzida, mas esse efeito não foi significativo (Fig. 4i; p = 0,0745). A duração da resposta, a largura de banda de sintonia e a latência da resposta não foram afetadas pela exposição ao LTE em animais tratados com LPS (Fig. 4d-f), indicando que a seletividade de frequência e a precisão das respostas de início não foram afetadas pela exposição ao LTE em animais tratados com LPS.
Em seguida, avaliamos se os limiares corticais de tons puros foram alterados pela exposição ao LTE. A partir da área de resposta de frequência (FRA) obtida em cada gravação, determinamos os limiares auditivos para cada frequência e calculamos a média desses limiares para ambos os grupos de animais. A Figura 4j mostra os limiares médios (± erro padrão da média) de 1,1 a 36 kHz em ratos tratados com LPS. A comparação dos limiares auditivos dos grupos Sham e Exposto mostrou um aumento substancial nos limiares dos animais expostos em comparação com os animais Sham (Figura 4j), um efeito que foi mais pronunciado em frequências baixas e médias. Mais precisamente, em frequências baixas (< 2,25 kHz), a proporção de neurônios A1 com limiar alto aumentou, enquanto a proporção de neurônios com limiar baixo e médio diminuiu (qui-quadrado = 43,85; p < 0,0001; Figura 4k, figura à esquerda). O mesmo efeito foi observado em frequências médias (2,25 < Freq(kHz) < 11): uma proporção maior de registros corticais com limiares intermediários e uma proporção menor de neurônios com limiares baixos em comparação com o grupo não exposto (Qui-quadrado = 71,17; p < 0,001; Figura 4k, painel central). Também houve uma diferença significativa no limiar para neurônios de alta frequência (≥ 11 kHz, p = 0,0059); a proporção de neurônios com limiar baixo diminuiu e a proporção de neurônios com limiar médio-alto aumentou (Qui-quadrado = 10,853; p = 0,04; Figura 4k, painel direito).
A Figura 5a mostra a distribuição de frequência ideal (BF, que provoca resposta máxima a 75 dB SPL) dos neurônios corticais obtida em animais saudáveis ​​dos grupos Sham e Exposto. A análise estatística mostrou que as duas distribuições foram semelhantes (qui-quadrado, p = 0,157), sugerindo que as comparações entre os dois grupos podem ser feitas sem viés de amostragem.
Efeitos da exposição à LTE em parâmetros quantificados de respostas corticais em animais saudáveis. (a) Distribuição do fluxo sanguíneo (FS) em neurônios corticais de animais saudáveis ​​expostos à LTE (azul escuro) e animais submetidos a exposição simulada à LTE (azul claro). Não há diferença entre as duas distribuições. (bf) Efeito da exposição à LTE em parâmetros que quantificam o campo receptivo temporal espectral (CRTE). Não houve alteração significativa na intensidade da resposta ao longo do CRTE e nas frequências ótimas (b, c). Há um leve aumento na duração da resposta (d), mas nenhuma alteração na largura de banda da resposta (e, f). Nem a intensidade nem a confiabilidade temporal das respostas às vocalizações foram alteradas (g, h). Não houve alteração significativa na atividade espontânea (i). (*p < 0,05, teste t não pareado). (j, k) Efeitos da exposição à LTE nos limiares corticais. Em média, os limiares não foram significativamente alterados em ratos expostos à LTE em comparação com ratos submetidos a exposição simulada, mas os limiares de frequência mais alta foram ligeiramente menores nos animais expostos.
As Figuras 5b-f mostram diagramas de caixa representando a distribuição e a média (linha vermelha) dos parâmetros derivados dos dois conjuntos de STRFs. Em animais saudáveis, a exposição à LTE em si teve pouco efeito sobre o valor médio dos parâmetros de STRF. Comparado com o grupo Sham (caixas azuis claras versus escuras para o grupo exposto), a exposição à LTE não alterou a intensidade total da resposta nem a resposta do BF (Fig. 5b,c; teste t não pareado, p = 0,2176 e p = 0,8696, respectivamente). Também não houve efeito na largura de banda espectral e na latência (p = 0,6764 e p = 0,7129, respectivamente), mas houve um aumento significativo na duração da resposta (p = 0,047). Também não houve efeito na força das respostas de vocalização (Fig. 5g, p = 0,4375), na confiabilidade entre tentativas dessas respostas (Fig. 5h, p = 0,3412) e na atividade espontânea (Fig. 5).5i; p = 0,3256).
A Figura 5j mostra os limiares médios (± erro padrão da média) de 1,1 a 36 kHz em ratos saudáveis. Não houve diferença significativa entre os ratos do grupo controle e os expostos, exceto por um limiar ligeiramente menor nos animais expostos em altas frequências (11–36 kHz) (teste t não pareado, p = 0,0083). Esse efeito reflete o fato de que, nos animais expostos, nessa faixa de frequência (qui-quadrado = 18,312, p = 0,001; Fig. 5k), havia um número ligeiramente maior de neurônios com limiares baixos e médios (enquanto que havia menos neurônios com limiares altos).
Em conclusão, quando animais saudáveis ​​foram expostos ao LTE, não houve efeito na intensidade da resposta a tons puros e sons complexos, como vocalizações. Além disso, em animais saudáveis, os limiares auditivos corticais foram semelhantes entre os animais expostos e os do grupo controle, enquanto que, em animais tratados com LPS, a exposição ao LTE resultou em um aumento substancial nos limiares corticais, especialmente nas faixas de baixa e média frequência.
Nosso estudo mostrou que, em ratos machos adultos com neuroinflamação aguda, a exposição a LTE-1800 MHz com um SARACx local de 0,5 W/kg (ver Métodos) resultou em uma redução significativa na intensidade das respostas evocadas por som em registros primários de comunicação. Essas alterações na atividade neuronal ocorreram sem qualquer mudança aparente na extensão do domínio espacial coberto pelos processos microgliais. Esse efeito do LTE na intensidade das respostas corticais evocadas não foi observado em ratos saudáveis. Considerando a similaridade na distribuição de frequência ideal entre as unidades de registro em animais expostos a LTE e animais do grupo controle, as diferenças na reatividade neuronal podem ser atribuídas a efeitos biológicos dos sinais de LTE, e não a viés de amostragem (Fig. 4a). Além disso, a ausência de alterações na latência da resposta e na largura de banda de sintonia espectral em ratos expostos a LTE sugere que, muito provavelmente, esses registros foram amostrados das mesmas camadas corticais, localizadas no córtex auditivo primário (ACx), e não em regiões secundárias.
Até onde sabemos, o efeito da sinalização LTE nas respostas neuronais não foi relatado anteriormente. No entanto, estudos prévios documentaram a capacidade da GSM-1800 MHz ou da onda contínua (CW) de 1800 MHz de alterar a excitabilidade neuronal, embora com diferenças significativas dependendo da abordagem experimental. Logo após a exposição à CW de 1800 MHz com um nível de SAR de 8,2 W/kg, registros de gânglios de caracol mostraram limiares reduzidos para o disparo de potenciais de ação e modulação neuronal. Por outro lado, a atividade de disparo e de rajadas em culturas neuronais primárias derivadas de cérebro de rato foi reduzida pela exposição à GSM-1800 MHz ou à CW de 1800 MHz por 15 minutos com um SAR de 4,6 W/kg. Essa inibição foi apenas parcialmente reversível em 30 minutos de exposição. O silenciamento completo dos neurônios foi alcançado com um SAR de 9,2 W/kg. A análise de dose-resposta mostrou que a GSM-1800 MHz Foi mais eficaz do que 1800 MHz CW na supressão da atividade em rajadas, sugerindo que as respostas neuronais dependem da modulação do sinal de radiofrequência.
Em nosso experimento, as respostas corticais evocadas foram coletadas in vivo de 3 a 6 horas após o término da exposição de 2 horas apenas na cabeça. Em um estudo anterior, investigamos o efeito do GSM-1800 MHz com SARACx de 1,55 W/kg e não encontramos efeito significativo nas respostas corticais evocadas por som em ratos saudáveis. Aqui, o único efeito significativo evocado em ratos saudáveis ​​pela exposição ao LTE-1800 com SARACx de 0,5 W/kg foi um leve aumento na duração da resposta à apresentação de tons puros. Esse efeito é difícil de explicar porque não é acompanhado por um aumento na intensidade da resposta, sugerindo que essa maior duração da resposta ocorre com o mesmo número total de potenciais de ação disparados pelos neurônios corticais. Uma explicação possível é que a exposição ao LTE pode reduzir a atividade de alguns interneurônios inibitórios, visto que já foi documentado que, no córtex auditivo primário, a inibição feedforward controla a duração das respostas das células piramidais desencadeadas pela entrada talâmica excitatória.
Em contraste, em ratos submetidos à neuroinflamação induzida por LPS, a exposição ao LTE não teve efeito na duração da atividade neuronal evocada por som, mas efeitos significativos foram detectados na intensidade das respostas evocadas. De fato, em comparação com as respostas neuronais registradas em ratos submetidos à cirurgia simulada com LPS, os neurônios em ratos tratados com LPS e expostos ao LTE exibiram uma redução na intensidade de suas respostas, um efeito observado tanto na apresentação de tons puros quanto de vocalizações naturais. A redução na intensidade da resposta a tons puros ocorreu sem um estreitamento da largura de banda de sintonia espectral de 75 dB e, como ocorreu em todas as intensidades sonoras, resultou em um aumento nos limiares acústicos dos neurônios corticais em frequências baixas e médias.
A redução na intensidade da resposta evocada indicou que o efeito da sinalização LTE em SARACx de 0,5 W/kg em animais tratados com LPS foi semelhante ao da GSM-1800 MHz aplicada em SARACx três vezes maior (1,55 W/kg)²⁸. Assim como na sinalização GSM, a exposição da cabeça à LTE-1800 MHz pode reduzir a excitabilidade neuronal em neurônios do ACx de ratos submetidos à neuroinflamação desencadeada por LPS. De acordo com essa hipótese, também observamos uma tendência à diminuição da confiabilidade dos ensaios nas respostas neuronais à vocalização (Fig. 4h) e à diminuição da atividade espontânea (Fig. 4i). No entanto, tem sido difícil determinar in vivo se a sinalização LTE reduz a excitabilidade intrínseca neuronal ou reduz a entrada sináptica, controlando assim as respostas neuronais no ACx.
Primeiramente, essas respostas mais fracas podem ser devidas à excitabilidade intrinsecamente reduzida das células corticais após a exposição à LTE de 1800 MHz. Corroborando essa ideia, a GSM-1800 MHz e a 1800 MHz-CW reduziram a atividade de disparo em rajadas quando aplicadas diretamente a culturas primárias de neurônios corticais de ratos com níveis de SAR de 3,2 W/kg e 4,6 W/kg, respectivamente, mas um nível de SAR limiar foi necessário para reduzir significativamente a atividade de disparo em rajadas. Apoiando a hipótese de excitabilidade intrínseca reduzida, também observamos taxas mais baixas de disparo espontâneo em animais expostos do que em animais submetidos a exposição simulada.
Em segundo lugar, a exposição à radiação cósmica de fundo (LTE) também pode afetar a transmissão sináptica de sinapses tálamo-corticais ou córtico-corticais. Numerosos estudos mostram que, no córtex auditivo, a amplitude da sintonia espectral não é determinada apenas por projeções talâmicas aferentes, mas que conexões intracorticais conferem entrada espectral adicional a sítios corticais39,40. Em nossos experimentos, o fato de a resposta espectral de frequência curta (STRF) cortical apresentar larguras de banda semelhantes em animais expostos e não expostos sugeriu indiretamente que os efeitos da exposição à LTE não se resumiam a efeitos na conectividade córtico-cortical. Isso também sugere que a maior conectividade em outras regiões corticais expostas à radiação cósmica de fundo (SAR) do que a medida no córtex auditivo (ACx) (Fig. 2) pode não ser responsável pelas respostas alteradas relatadas aqui.
Aqui, uma proporção maior de registros corticais expostos a LPS mostrou limiares elevados em comparação com animais expostos a LPS simuladamente. Dado que foi proposto que o limiar acústico cortical é controlado principalmente pela força da sinapse tálamo-cortical39,40, pode-se suspeitar que a transmissão tálamo-cortical seja parcialmente reduzida pela exposição, seja no nível pré-sináptico (redução da liberação de glutamato) ou pós-sináptico (redução do número ou da afinidade dos receptores).
Semelhante aos efeitos do GSM-1800 MHz, as respostas neuronais alteradas induzidas pelo LTE ocorreram no contexto da neuroinflamação desencadeada por LPS, caracterizada por respostas microgliais. Evidências atuais sugerem que a microglia influencia fortemente a atividade das redes neuronais em cérebros normais e patológicos41,42,43. Sua capacidade de modular a neurotransmissão depende não apenas da produção de compostos que podem ou não limitar a neurotransmissão, mas também da alta motilidade de seus prolongamentos celulares. No córtex cerebral, tanto o aumento quanto a diminuição da atividade das redes neuronais desencadeiam uma rápida expansão do domínio espacial da microglia devido ao crescimento de seus prolongamentos44,45. Em particular, as protrusões microgliais são recrutadas próximas a sinapses tálamo-corticais ativadas e podem inibir a atividade de sinapses excitatórias por meio de mecanismos que envolvem a produção local de adenosina mediada pela microglia.
Em ratos tratados com LPS e submetidos a GSM-1800 MHz com SARACx a 1,55 W/kg, observou-se diminuição da atividade dos neurônios ACx com crescimento de prolongamentos microgliais, marcados por áreas significativas coradas para Iba1 no ACx28. Essa observação sugere que a remodelação microglial desencadeada pela exposição ao GSM pode contribuir ativamente para a redução induzida pelo GSM nas respostas neuronais evocadas por som. Nosso estudo atual contesta essa hipótese no contexto da exposição da cabeça a LTE com SARACx limitado a 0,5 W/kg, visto que não encontramos aumento na área espacial coberta por prolongamentos microgliais. Contudo, isso não descarta qualquer efeito da sinalização LTE sobre a microglia ativada por LPS, o que pode, por sua vez, afetar a atividade neuronal. Estudos adicionais são necessários para responder a essa questão e determinar os mecanismos pelos quais a neuroinflamação aguda altera as respostas neuronais à sinalização LTE.
Até onde sabemos, o efeito dos sinais LTE no processamento auditivo não foi estudado anteriormente. Nossos estudos anteriores 26,28 e o presente estudo mostraram que, em um contexto de inflamação aguda, a exposição da cabeça isoladamente a GSM-1800 MHz ou LTE-1800 MHz resultou em alterações funcionais nas respostas neuronais no córtex auditivo (ACx), conforme demonstrado pelo aumento do limiar auditivo. Por pelo menos dois motivos principais, a função coclear não deve ser afetada pela nossa exposição ao LTE. Primeiro, como mostrado no estudo de dosimetria apresentado na Figura 2, os níveis mais altos de SAR (próximos a 1 W/kg) estão localizados no córtex dorsomedial (abaixo da antena) e diminuem substancialmente à medida que se move lateralmente para a parte ventral da cabeça. Estima-se que seja de cerca de 0,1 W/kg no nível da orelha externa do rato (abaixo do canal auditivo). Segundo, quando as orelhas de cobaias foram expostas por 2 meses a GSM 900 MHz (5 dias/semana, 1 hora/dia, SAR entre 1 e 4 W/kg), não houve alterações detectáveis ​​na magnitude do produto de distorção. Limiares otoacústicos para emissão e respostas auditivas do tronco encefálico 47. Além disso, a exposição repetida da cabeça a GSM 900 ou 1800 MHz com uma SAR local de 2 W/kg não afetou a função das células ciliadas externas da cóclea em ratos saudáveis48,49. Esses resultados ecoam dados obtidos em humanos, onde investigações mostraram que a exposição de 10 a 30 minutos a campos eletromagnéticos de telefones celulares GSM não tem efeito consistente no processamento auditivo, avaliado no nível da cóclea50,51,52 ou do tronco encefálico53,54.
Em nosso estudo, alterações na atividade neuronal desencadeadas por LTE foram observadas in vivo de 3 a 6 horas após o término da exposição. Em um estudo anterior sobre a parte dorsomedial do córtex, diversos efeitos induzidos por GSM-1800 MHz observados 24 horas após a exposição não eram mais detectáveis ​​72 horas após a exposição. Isso se aplica à expansão dos processos microgliais, à regulação negativa do gene IL-1β e à modificação pós-translacional dos receptores AMPA. Considerando que o córtex auditivo apresenta um valor de SAR (taxa de absorção específica) menor (0,5 W/kg) do que a região dorsomedial (2,94 W/kg26), as alterações na atividade neuronal relatadas aqui parecem ser transitórias.
Nossos dados devem levar em consideração os limites de SAR (Taxa de Absorção Específica) e as estimativas dos valores reais de SAR atingidos no córtex cerebral de usuários de telefones celulares. Os padrões atuais utilizados para proteger o público estabelecem o limite de SAR em 2 W/kg para exposição localizada da cabeça ou do tronco a radiofrequências na faixa de 100 kHz a 6 GHz.
Simulações de dose foram realizadas utilizando diferentes modelos de cabeça humana para determinar a absorção de potência de radiofrequência (RF) em diferentes tecidos da cabeça durante a comunicação geral por telefone celular. Além da diversidade de modelos de cabeça humana, essas simulações destacam diferenças ou incertezas significativas na estimativa da energia absorvida pelo cérebro com base em parâmetros anatômicos ou histológicos, como a forma externa ou interna do crânio, espessura ou conteúdo de água. Os diferentes tecidos da cabeça variam amplamente de acordo com a idade, sexo ou características individuais 56,57,58. Além disso, as características do telefone celular, como a localização interna da antena e a posição do telefone em relação à cabeça do usuário, influenciam fortemente o nível e a distribuição dos valores de SAR no córtex cerebral 59,60. No entanto, considerando as distribuições de SAR relatadas no córtex cerebral humano, que foram estabelecidas a partir de modelos de telefone celular emitindo radiofrequências na faixa de 1800 MHz 58,59,60, parece que os níveis de SAR alcançados no córtex auditivo humano ainda representam menos da metade do córtex cerebral humano. estudo (SARACx 0,5 W/kg). Portanto, nossos dados não desafiam os limites atuais dos valores de SAR aplicáveis ​​ao público.
Em conclusão, nosso estudo demonstra que uma única exposição da cabeça à LTE-1800 MHz interfere nas respostas neuronais dos neurônios corticais a estímulos sensoriais. De acordo com caracterizações anteriores dos efeitos da sinalização GSM, nossos resultados sugerem que os efeitos da sinalização LTE na atividade neuronal variam conforme o estado de saúde. A neuroinflamação aguda sensibiliza os neurônios à LTE-1800 MHz, resultando em alterações no processamento cortical de estímulos auditivos.
Os dados foram coletados aos 55 dias de idade, a partir do córtex cerebral de 31 ratos Wistar machos adultos obtidos no laboratório de Janvier. Os ratos foram mantidos em instalações com umidade (50-55%) e temperatura (22-24 °C) controladas, com ciclo claro/escuro de 12 h/12 ​​h (luzes acesas às 7h30) e livre acesso a água e comida. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (Diretiva 2010/63/UE), que são semelhantes às descritas nas Diretrizes da Sociedade de Neurociência para o Uso de Animais em Pesquisa Neurocientífica. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Paris-Sud e Centro (CEEA nº 59, Projeto 2014-25, Protocolo Nacional 03729.02), utilizando procedimentos validados por este comitê em 32-2011 e 34-2012.
Os animais foram habituados às câmaras de colônia por pelo menos 1 semana antes do tratamento com LPS e da exposição (ou exposição simulada) ao LTE-EMF.
Vinte e dois ratos receberam injeção intraperitoneal (ip) de LPS de E. coli (250 µg/kg, sorotipo 0127:B8, SIGMA) diluído em solução salina isotônica estéril e livre de endotoxinas 24 horas antes da exposição ao LTE ou à simulação (n por grupo). Em ratos Wistar machos de 2 meses de idade, o tratamento com LPS produz uma resposta neuroinflamatória marcada no córtex cerebral pela regulação positiva de vários genes pró-inflamatórios (fator de necrose tumoral alfa, interleucina 1β, CCL2, NOX2, NOS2) 24 horas após a injeção de LPS, incluindo um aumento de 4 e 12 vezes nos níveis de transcritos que codificam a enzima NOX2 e a interleucina 1β, respectivamente. Nesse ponto de 24 horas, a microglia cortical exibiu a morfologia celular "densa" típica esperada pela ativação pró-inflamatória das células desencadeada por LPS (Figura 1), o que contrasta com a ativação desencadeada por LPS em outros casos. A ativação pró-inflamatória celular corresponde a 24, 61.
A exposição da cabeça ao campo eletromagnético LTE foi realizada utilizando a configuração experimental previamente usada para avaliar o efeito do campo eletromagnético GSM26. A exposição ao LTE foi realizada 24 horas após a injeção de LPS (11 animais) ou sem tratamento com LPS (5 animais). Os animais foram levemente anestesiados com cetamina/xilazina (cetamina 80 mg/kg, ip; xilazina 10 mg/kg, ip) antes da exposição para evitar movimentos e garantir que a cabeça do animal estivesse na antena de laço que emite o sinal LTE (localização reproduzível abaixo). Metade dos ratos da mesma gaiola serviu como controle (11 animais submetidos à exposição simulada, de um total de 22 ratos pré-tratados com LPS): eles foram colocados sob a antena de laço e a energia do sinal LTE foi ajustada para zero. Os pesos dos animais expostos e dos animais submetidos à exposição simulada foram semelhantes (p = 0,558, teste t não pareado, ns). Todos os animais anestesiados foram colocados em uma placa de aquecimento sem metal para manter sua temperatura corporal. A temperatura foi mantida em torno de 37°C durante todo o experimento. Assim como nos experimentos anteriores, o tempo de exposição foi definido em 2 horas. Após a exposição, o animal foi colocado em outra placa de aquecimento na sala de cirurgia. O mesmo procedimento de exposição foi aplicado a 10 ratos saudáveis ​​(não tratados com LPS), metade dos quais foi submetida a uma exposição simulada na mesma gaiola (p = 0,694).
O sistema de exposição era semelhante aos sistemas descritos em estudos anteriores, com a substituição do gerador de radiofrequência por um gerador de campos eletromagnéticos LTE em vez de GSM. Resumidamente, um gerador de RF (SMBV100A, 3,2 GHz, Rohde & Schwarz, Alemanha) emitindo um campo eletromagnético LTE de 1800 MHz foi conectado a um amplificador de potência (ZHL-4W-422+, Mini-Circuits, EUA), um circulador (D3 1719-N, Sodhy, França), um acoplador bidirecional (CD D 1824-2, −30 dB, Sodhy, França) e um divisor de potência de quatro vias (DC D 0922-4N, Sodhy, França), permitindo a exposição simultânea de quatro animais. Um medidor de potência (N1921A, Agilent, EUA) conectado a um acoplador bidirecional permitiu a medição e o monitoramento contínuos da potência incidente e refletida dentro do dispositivo. Cada saída foi conectada a uma antena de quadro. (Sama-Sistemi srl; Roma), permitindo a exposição parcial da cabeça do animal. A antena de laço consiste em um circuito impresso com duas linhas metálicas (constante dielétrica εr = 4,6) gravadas em um substrato isolante de epóxi. Em uma extremidade, o dispositivo consiste em um fio de 1 mm de largura formando um anel colocado próximo à cabeça do animal. Como em estudos anteriores26,62, a taxa de absorção específica (SAR) foi determinada numericamente usando um modelo numérico de rato e um método de diferenças finitas no domínio do tempo (FDTD)63,64,65. Elas também foram determinadas experimentalmente em um modelo homogêneo de rato usando sondas Luxtron para medir a elevação da temperatura. Nesse caso, a SAR em W/kg é calculada usando a fórmula: SAR = C ΔT/Δt, onde C é a capacidade térmica em J/(kg K), ΔT, em °K e Δt a variação de temperatura, em segundos. Os valores de SAR determinados numericamente foram comparados com os valores de SAR experimentais obtidos usando um modelo homogêneo, especialmente em regiões equivalentes do cérebro de ratos. A diferença entre as medições numéricas de SAR e os valores de SAR detectados experimentalmente é inferior a 30%.
A Figura 2a mostra a distribuição da SAR no cérebro do rato no modelo experimental, que corresponde à distribuição em termos de peso corporal e tamanho dos ratos utilizados em nosso estudo. A SAR média no cérebro foi de 0,37 ± 0,23 W/kg (média ± DP). Os valores de SAR são mais elevados na área cortical logo abaixo da antena de laço. A SAR local no córtex auditivo (SARACx) foi de 0,50 ± 0,08 W/kg (média ± DP) (Figura 2b). Como os pesos corporais dos ratos expostos são homogêneos e as diferenças na espessura do tecido da cabeça são negligenciáveis, espera-se que a SAR real do córtex auditivo ou de outras áreas corticais seja muito semelhante entre um animal exposto e outro.
Ao final da exposição, os animais receberam doses adicionais de cetamina (20 mg/kg, ip) e xilazina (4 mg/kg, ip) até que nenhum movimento reflexo fosse observado após o pinçamento da pata traseira. Um anestésico local (Xylocaína 2%) foi injetado por via subcutânea na pele e no músculo temporal acima do crânio, e os animais foram colocados em um sistema de aquecimento sem metal. Após posicionar o animal no aparelho estereotáxico, foi realizada uma craniotomia sobre o córtex temporal esquerdo. Como em nosso estudo anterior⁶⁶, partindo da junção dos ossos parietal e temporal, a abertura tinha 9 mm de largura e 5 mm de altura. A dura-máter acima do córtex cingulado anterior (ACx) foi cuidadosamente removida sob controle binocular, sem danificar os vasos sanguíneos. Ao final do procedimento, uma base foi construída com cimento acrílico odontológico para fixação atraumática da cabeça do animal durante a gravação. O aparelho estereotáxico, com o animal em suporte, foi posicionado em uma câmara de atenuação acústica (IAC, modelo AC1).
Os dados foram obtidos a partir de registros multiunitários no córtex auditivo primário de 20 ratos, incluindo 10 animais pré-tratados com LPS. Os registros extracelulares foram obtidos a partir de uma matriz de 16 eletrodos de tungstênio (TDT, ø: 33 µm, < 1 MΩ) composta por duas fileiras de 8 eletrodos espaçados 1000 µm entre si (350 µm entre eletrodos na mesma fileira). Um fio de prata (ø: 300 µm) para aterramento foi inserido entre o osso temporal e a dura-máter contralateral. A localização estimada do córtex auditivo primário é de 4 a 7 mm posterior ao bregma e 3 mm ventral à sutura supratemporal. O sinal bruto foi amplificado 10.000 vezes (TDT Medusa) e então processado por um sistema de aquisição de dados multicanal (RX5, TDT). Os sinais coletados de cada eletrodo foram filtrados (610–10.000 Hz). Para extrair a atividade multiunitária (MUA), os níveis de disparo foram cuidadosamente definidos para cada eletrodo (por coautores que desconheciam os estados de exposição ou placebo) para selecionar o maior potencial de ação do sinal. A inspeção online e offline das formas de onda mostrou que a MUA coletada consistia em potenciais de ação gerados por 3 a 6 neurônios próximos aos eletrodos. No início de cada experimento, definimos a posição da matriz de eletrodos de forma que duas fileiras de oito eletrodos pudessem amostrar os neurônios, desde respostas de baixa até alta frequência, quando realizadas na orientação rostral.
Os estímulos acústicos foram gerados no Matlab, transmitidos para um sistema de distribuição de som baseado em RP2.1 (TDT) e enviados para um alto-falante Fostex (FE87E). O alto-falante foi posicionado a 2 cm da orelha direita do rato, distância na qual produziu um espectro de frequência plano (± 3 dB) entre 140 Hz e 36 kHz. A calibração do alto-falante foi realizada utilizando ruído e tons puros gravados com um microfone Bruel & Kjaer 4133 acoplado a um pré-amplificador B&K 2169 e um gravador digital Marantz PMD671. O Campo Receptivo Temporal Espectral (STRF) foi determinado utilizando 97 frequências de tons gama, abrangendo 8 oitavas (0,14–36 kHz), apresentadas em ordem aleatória a 75 dB SPL a 4,15 Hz. A Área de Resposta de Frequência (FRA) foi determinada utilizando o mesmo conjunto de tons, apresentados em ordem aleatória a 2 Hz de 75 a 5 dB SPL. Cada frequência é apresentada oito vezes em cada intensidade.
As respostas a estímulos naturais também foram avaliadas. Em estudos anteriores, observamos que as vocalizações de ratos raramente provocavam respostas fortes no ACx, independentemente da frequência ótima neuronal (BF), enquanto vocalizações específicas de xenotransplantes (por exemplo, vocalizações de pássaros canoros ou de cobaias) tipicamente afetavam todo o mapa tonal. Portanto, testamos as respostas corticais a vocalizações em cobaias (o apito usado em 36 foi associado a 1 s de estímulos, apresentados 25 vezes).

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